circRNA与CRISPR-Cas9的结合 | 水稻circRNA功能鉴定

近年来，circRNA的研究虽盛，而多集中在对人和动物的研究中，在植物中的研究较少，且在植物中的研究一般集中在对circRNA的鉴定及注释上，对其功能鉴定的研究则更少。

电子科大张勇和马里兰大学戚益平团队利用基因编辑技术对水稻中circRNA进行功能鉴定，实现了植物中circRNA基因编辑的首次研究报道。并且，此项研究还首次为植物中circRNA竞争结合miRNA，构建circRNA–miRNA–mRNA网络机制，提供了遗传实验证明。虽然在人和动物中ceRNA调控网络较为常见，但在植物中，这样的研究并不多见。接下来，让我们一起来看一下这篇文章：

1． 应用CRISPR-Cas9多重编辑获得水稻中四个CircRNAs的敲除突变体

基于前期对水稻circRNA的转录组分析研究结果，作者在水稻中选择了4个转录丰度相对较高的circRNA作为研究目标，它们分别来源于内含子和基因间区（图1a）。为了将对宿主基因或侧翼基因的干扰降至最低，作者设计了一对单导向RNA（sgRNA），其靶向位点位于每个circRNA编码区的边缘或外部（图1a）。并使用四个多重T-DNA载体（pZJP053，pZJP054，pZJP055和pZJP057）来靶向这四个目的circRNA基因（图 1b））。在每个构建体中，分别使用不同的启动子表达（图 1b）。为评估这些载体的编辑效率，作者将载体瞬时转化到水稻原生质体中，并通过PCR检测circRNA基因座处Cas9介导的染色体缺失产生的产物，检测到在所有四种情况下都发生了circRNA基因的染色体缺失，缺失率13.8％~30.9％（图 1c）。

图1

接下来，作者使用多重CRISPR-Cas9构建体对水稻进行稳定的转化，并通过筛选获取T1代中每个circRNA独立的纯合缺失基因型（图2）。

图 2

2. 水稻缺失突变体中circRNA基因及其亲本或侧翼基因的转录分析

为了验证circRNA突变体中对应的circRNA转录本是否缺失，以及了解circRNA突变体中circRNA宿主基因或侧翼基因是否发生改变，作者进行RT-PCR（图2a）、qRT-PCR（图2b）以及RNA-seq进行探究。结果发现在circRNA突变体中，除了上游位于Os03circ00204侧翼的基因Os03g01350，宿主或侧翼基因的表达基本未受影响。由于Os03circ00204侧翼的基因Os03g01350表达情况发生变化，故在将表型与突变体os03circ00204的基因型联系起来时需要注意辨别引起表型变化的可能是Os03g01350的表达增加，而不是os03circ00204的功能丧失。

图 3

3.circRNA突变体的表型分析

在获取circRNA突变体后，作者开始对circRNA突变体与野生型植株之间可能存在的表型差异进行探究。研究发现在种子萌发和早期生长时，通过盐胁迫处理下，circRNA突变体之间出现不同的响应，Os02circ25329，Os06circ02797和Os03circ00204突变体对于高浓度的盐胁迫相比于野生型更加敏感，而Os05circ02465突变体（Δ1和Δ2）对盐胁迫表现出明显的耐受性（图 4a和b）。而对于植株成熟体表型及在其他非生物胁迫条件下，四个circRNA突变体植株与野生型之间并没有表现出明显差异。

图 4

4. 水稻circRNA突变体中差异表达基因的RNA-seq分析

根据circRNA突变体在植株萌发和幼苗的差异表型，作者推测这些circRNA可能调节水稻中miRNA和mRNA的丰度。另外，作者根据small RNA-seq和mRNA-seq对 miRNA和蛋白编码mRNA进行转录谱分析，获取差异基因(图5a/b)，并进一步对四种circRNA突变体中的差异表达基因分别进行富集分析，发现这些circRNA可能独立地参与不同的细胞代谢和信号通路（图5c）。

图 5

5. Os06circ02797负调控OsMIR408的表达

基于前期的表型分析以及转录表达谱分析，鉴于os06circ02797∆1突变体在种子萌发和幼苗生长中均表现出更多差异表达的miRNA和mRNA，并且该突变体均具有表型（图 6b），作者开始试图探索与Os06circ02797相关的circRNA-miRNA-mRNA调控网络。推测Os06circ02797可以结合OsMIR408，从而对OsMIR408产生负调控。为了验证这一假设，作者采用了qRT - PCR来定量OsMIR408在突变体os06circ02797∆1和野生型植物中的相对表达量，并在os06circ02797∆1突变体中观察到了OsMIR408的更高表达（图 6e）。此外，qRT-PCR分析表明，九个假定的OsMIR408靶基因中有七个在os06circ02797∆1突变体中表达明显降低（图 6e）。mRNA表达序列数据进一步证实了基因表达改变的这些趋势。另外，ceRNA分析表明，Os06circ02797有许多公认的结合位点OsMIR408（图 6F）。这些数据有力地支持了水稻中的Os06circ02797 - OsMIR408 -mRNA调控网络，Os06circ02797可能有助于微调OsMIR408靶基因的表达（图 6g）。

图 6

此项研究对于植物中circRNA的研究具有重要的意义，不仅为获取植物circRNA基因敲除突变体提供了一种有效且可靠的策略，并为植物中ceRNA调控提供了遗传证明，同时也为作物改良提供了新的研究基因和方向，值得一读。

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